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2014年~2017年猪伪狂犬病原与野毒gE抗体监测数据统计分析与预防对策

2014年~2017年猪伪狂犬病原与野毒gE抗体监测数据统计分析与预防对策

赛尔畜牧 2017-12-15 14:36:39 |

[导读] 牟迪,夏伟,唐志芬,张宇辉,朱庆虎,袁远,熊永忠 哈尔滨维科生物技术开发公司

  猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种高度接触性传染病。作为危害全球养猪业最严重的猪传染病之一,感染猪伪狂犬病引起的主要症状有种猪繁殖障碍、仔猪呼吸道综合征、神经症状、腹泻、生长发育受阻等。20周龄以下的仔猪感染率和死亡率可达100%,成年猪常呈隐性潜伏感染或长期带毒的状态,当环境激变或者被其它应激因素激发,往往可与其它病原体协同作用引起多种疾病的发生,从而引起疫病的暴发。

  目前,我国应用伪狂犬基因工程缺失疫苗对PR进行免疫,使得该病的流行趋势有所缓和,但该病的潜伏感染情况还是相当普遍,其临床症状已经从典型转为非典型,虽死亡率大大降低,但是却严重影响猪群的生长速度和繁殖性能,给我国养猪业造成严重的经济损失。因此,做好猪场伪狂犬病的病原检测和血清学监测,及时清除隐性带毒猪,净化猪群至关重要。

  为掌握现有的防疫控制体系下我国猪场伪狂犬感染的状况,为有效控制和消灭猪伪狂犬病提供科学依据,哈兽维科市场技术服务部检测实验室于2014年~2017年期间共收到全国28个省市443个规模猪场的1636份病料(淋巴结和脑组织),30个省市874个规模猪场的33517份血清样品。通过PCR及ELISA方法对伪狂犬病原与野毒gE抗体进行监测,现将结果报告如下。

  1、材料与方法

  1.1 样品来源及分布

  1.1.1 病原检测样品

  样品来源于全国28个省市443个猪场,样品包括淋巴结和脑等组织共1636份,通过调查了解猪场免疫背景和临床发病情况以及剖检典型发病猪取组织样品,-20℃冷冻送检。

  1.1.2 血清样品

  样品来自全国30个省(直辖市)874个规模化猪场,血清样品合计共33517份。通过猪前腔静脉或耳缘静脉现场采集后分离血清送检。

  1.2 主要试剂和仪器

  TaKaRa One Step DNA PCR Kit试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)、MEM营养液、DNA提取试剂盒(购自天根生物科技有限公司)、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEP水、琼脂糖、DL2000 Marker。

  生物安全柜、分析天平、研磨器、高速离心机、迷你掌上离心机、涡旋振荡器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪、冰箱、微波炉、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、酶标仪等。

  1.3引物设计与合成

  根据GenBank登陆的PRV的基因序列,用Oligo6.0软件设计引物,由宝生物工程(大连)有限公司合成。

  1.4 样品处理

  1.4.1 核酸提取

  按检测需求分别对取脑和淋巴结样品混合,用研磨器充分研磨,利用MEM营养液进行10倍稀释,然后利用DNA提取试剂盒进行核酸抽提。

  1. 4.2待检血清的制备

  血清样品室温静置2h~6h后,3000r/min离心15min,取上清置于灭菌EP管或小瓶内,编号。对于没有条件分离血清的猪场,室温静置,让其自然析出血清,尽快送达实验室。处理好的血清均置于-20℃保存备用。

  1.5 病毒核酸检测

  用天根生物科技有限公司DNA提取试剂盒,从病毒培养液提取DNA为模板,采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit试剂盒进行PCR扩增,反应条件94℃ 2 min;(94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1min)×35个循环,72℃延伸10min,PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

  1.6 ELISA方法检测

  按照猪伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒的操作说明进行(金诺诊断)。

  1.7 结果判定

  1.7.1 PCR

  病原检测结果判定PRV阳性对照出现1245bp扩增带,阴性对照无带出现时,试验结果成立。被检样品出现1245bp扩增带为阳性,否则为阴性。

  1.7.2 ELISA

  检测结果判定阴性对照A(650)的平均值减去阳性对照A(650)的平均值必须大于或等于0.3,试验方能有效。如果S/N值(样品/阴性对照比率)低于或等于0.60,样品应判定为PRV gE抗体阳性。如果S/N值大于0.60但小于或等于0.70,样品应重测。如果试验结果不变,间隔一定时间后重新采样、检测。如果S/N值大于0.70,样品应判定为PRV gE抗体阴性。

  2、结果

  2.1 PCR扩增结果

  2.1.1 2014年至2017年PRV抗原阳性率

  2014年1月~2017年5月期间对28个省443个规模猪场送检1636份淋巴结和脑组织样品,进行了PRV病原的检测。

  结果显示:2014年PRV病原阳性检出率12.42%(41/330),2015年PRV病原阳性检出率6.50%(24/369),2016年PRV病原阳性检出率16.86%(100/593),2017年1月~5月PRV病原阳性检出率9.01%(31/344),2014年1月~2017年5月PRV病原总体检出率为11.98%(196/1636)(如表1、图1)。

表1 2014年~2017年PRV抗原阳性率

图1 2014年~2017年PRV-gE抗体阳性率

  2.1.2 病料样品

  病料样品来自全国28个省市,其中黑龙江、辽宁、山东、福建、江西送检占比相对较高,湖南、江苏、青海等地PRV病原检出率相对较高(如表2)。如果按照地区统计,所有地区均存在不同程度的PRV(gE)野毒感染情况,其中西北和西南地区猪场的PRV病原阳性率较高(图2)。

表2 病料来源及PRV病原阳性率

图2 不同地区PRV病原阳性率和PRV(gE)抗体阳性率

  2.2 ELISA检测结果

  应用阻断ELISA方法对2014年1月~2017年5月期间全国30个省、市874个规模化猪场送检的33517份血清样本进行检测的结果表明,PRV抗体阳性血清12795份,总体抗体阳性率为38.17%;其中,2014年PRVgE抗体阳性率为26.70%(1721/6446),2015年PRVgE抗体阳性率为38.07%(6699/2550),2016年PRVgE抗体阳性率为43.62%(5722/13119),2017年1~5月PRVgE抗体阳性率为38.63%(2802/7253)(如表3,图3)。

表3 2014年~2017年PRV野毒抗体阳性率

图3 2014年~2017年PRV野毒抗体阳性率

  血清样品来自全国30个省市,其中广东、辽宁、河北、北京送检占比相对较高,河南、河北、天津、新疆等地PRVgE抗体阳性率相对较高(如表4)。如果按照地区统计,华中和华北地区猪场的PRVgE抗体阳性率较高(图2)。

表4 血清来源及PRV(gE)野毒抗体阳性率

  2014年1月~2017年5月通过对全国28个省市443个规模猪场的1636份淋巴结和脑组织样品,检测PRV的样品主要以发病猪脑为主,临床上表现典型神经症状,如肌肉震颤、精神沉郁、口吐白沫等哺乳仔猪和保育猪发病为主。

  部分猪场爆发时以母猪流产、早产、死胎等,保育猪神经症状和生长育成猪严重呼吸道病为典型临床表现。剖检后脑出血病变严重。

  选用合适的引物,采用PCR方法对PRV病原检测和数据统计分析得知,2014年PRV阳性检出率12.42%(41/330),2015年PRV病原阳性检出率下降为6.50%(24/369),2016年PRV病原阳性检出率又有所上升,为16.86%(100/593),2017年1月~5月PRV病原阳性检出率9.01%(31/344),相比2016年有所下降。2014年1月~2017年5月总体病原检出率为11.98%(196/1636)。

  2014年1月~2017年5月期间,对全国30个省、市874个规模化猪场送检的33517份血清样本通过ELISA方法进行PRV(gE)抗体检测,结果显示,2014年PRV(gE)抗体阳性率为26.70%(1721/6446),2015年PRV(gE)抗体阳性率上升为38.07%(6699/2550),2016年检测PRV(gE)抗体阳性率继续上升,达到43.62%(5722/13119),2017年1~5月PRV(gE)抗体阳性率略有下降,为38.63%(2802/7253),2014年1月~2017年5月总的PRV(gE)抗体阳性率为38.17%(12795/33517)。通过上述数据可以看出我国猪场猪伪狂犬野毒感染依然严重。

  对不同地理分布猪场的调查中发现,我国西北地区的伪狂犬病原检出率(25.00%)最高,其次为西南地区(16.44%)。而在PRV(gE)抗体检测方面,华中地区(58.65%)和华北地区(51.46%)PRV(gE)抗体阳性率较高。不同地区检出率的差异与区域内猪场的疫苗防疫、饲养管理、生物安全等诸多因素有关。调查结果显示检测的874家猪场没有伪狂犬野毒gE抗体阴性场,对于猪伪狂犬病的防制乃至净化,情况不容乐观。

  做好猪场伪狂犬病的控制与净化。包含疫苗免疫、生物安全和饲养管理等各个方面的工作。对于疫苗的免疫,针对当前的猪伪狂犬病毒的流行情况,推荐种公猪/母猪一年普免3次~4次,2头份/头,仔猪1日~3日龄滴鼻1头份/头(PRV-gE抗体阴性的猪场可不滴鼻),45日~55日龄二免2头份/头,90日~100日龄三免2头份/头。由于存在种猪带毒导致猪场暴发猪伪狂犬病,或者继发其它疾病的危险。因此,猪场要做好种猪场伪狂犬病的病原检测和血清学监测。对于带毒种猪要及时清除,净化猪群。在疫苗免疫的同时,做好生物安全措施,加强饲养管理,才能很好的控制以及净化猪伪狂犬病。

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