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某猪场猪瘟病例的综合诊断及疫苗免疫效果评价

某猪场猪瘟病例的综合诊断及疫苗免疫效果评价

赛尔畜牧 2017-11-21 11:27:29 |

[导读] 古金元[] ,王玉超,彭涛,马梓承,刘照虎,孟凡亮,王文武,刘思当* 山东农业大学动物科技学院

  2017年3月山东省莱芜市某猪场保育猪群发生以高热(40.8~41.5℃)、精神高度沉郁、食欲不振、皮肤出血潮红及耳尖发绀为主要症状的急性热性传染病。为明确引起此次疫情的致病因素,对患病猪进行了病理剖检、组织病理学检查、分子生物学检测、病毒分离与鉴定,对分离病毒又进行了E2基因的分子克隆测序及同源性比对试验,最终确定该病由猪瘟病毒感染引起,并分离到一株猪瘟病毒(SDLW2017)。该病毒株E2基因全长1119个碱基(nt),共编码373个氨基酸(aa);相似性分析表明,SDLW2017分离株与其它参考株的核苷酸相似性介于82.1%~96.3%之间,氨基酸相似性介于88.5%~97.6%之间。与1.1亚群的HCLV株具有最低的核苷酸(82.1%)和氨基酸相似性(88.5%),而与2.1亚群的参考株具有较高的核苷酸(91.8%~96.3%)和氨基酸相似性(95.2%~97.6%)。其中与2.1b亚型参考株(GXWZ02)的相似性最高,核苷酸相似性为96.3%,氨基酸相似性为97.6%。

  猪瘟(Classical swine fever,CSF)是一种由猪瘟病毒(CSFV)引起的、可以对养猪业造成重大损失的高度接触性传染病。当前在临床上,根据其表现症状不同,可分为6种病型:最急性型、急性型、亚急性型、慢性型、持续感染型和复杂感染型[1],不同病型的临床表现各异。目前,猪瘟临床病例主要以非典型性症状为主,母猪不表现明显的临床症状,但是却因母猪繁殖障碍造成新生仔猪的慢性死亡或继发其他疾病[2]。

  目前猪瘟的诊断方法主要有以下几种:(1)临床病理学诊断,病猪的临床症状和组织病理学变化对猪瘟的初步诊断具有一定指导意义,但是对于疾病的确诊则存在局限性;(2)中和试验,该方法主要用于检测猪体内猪瘟抗体水平。该方法方便、省时省力,但无法对猪瘟抗体滴度进行精确检测;(3)酶联免疫吸附试验(ELISA),该法灵敏度高,而且可一次性进行大批量抗体检测,但是无法确切评估猪群的感染情况;(4)免疫荧光抗体试验,运用该技术能够观察到病毒的分布及增殖动态过程,具有相当高的准确性,但是灵敏度稍差、操作过程比较繁琐,实验成本很高、结果判定受人为因素影响很大;(5)分子生物学诊断,当前最常用的分子生物学检测方法是聚合酶链式反应技术(PCR),逆转录PCR或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),为PCR技术的一种广泛应用的完善。RT-PCR 技术已经广泛用于猪瘟病毒的实验室检测,根据不同病原的基因序列设计相应的特异性引物,能够区分常见猪病中的多种病原。为了进一步提高检测的效率,多重RT-PCR技术应运而生,多重 RT-PCR 是一种快速、高效、高敏的实验室检测手段,只需进行一次试验就可以检测多种病毒,为实验室检测的开展提供了很大的便利[3-5]。

  猪场爆发猪瘟疫情后,目前尚无有效的药物防治方法,从而对猪场的正常生产管理和生产成绩会产生较大影响。所以必须借助实验室进行综合诊断,快速确诊,以便采取针对性的防控措施,减少细菌等继发感染,避免疫情蔓延。而抗体检测能够明确猪群的免疫状态并指导免疫程序的优化调整,因此疫情控制的同时对全场猪群进行系统的猪瘟抗体检测,并以此为依据,不断优化猪场猪瘟免疫程序,化解猪瘟疫病发生风险。现就一猪瘟病毒感染的临床病例进行的综合诊断,以及对分离到的CSFV的E2基因测序、分析报道如下。

  1 材料与方法

  1.1患病猪场发病背景及样品采集

  猪瘟疑似病料采自山东省莱芜市某规模化猪场,该场保育后期猪群发生以高热(40.8℃~41.5℃)、精神沉郁、食欲不振、皮肤潮红及耳尖发绀为主要特征的急性热性传染病,发病率约20%(75/370),三天内死亡率为36%(27/75)。猪场技术人员对发病猪只肌注退烧药后,未见明显疗效,遂送来2头病猪请求实验室进行准确诊断。

  1.2 送检病猪的临床检查

  对送检病猪解剖前进行临床检查,发现病猪主要表现为精神高度沉郁、食欲下降乃至废绝、喜欢扎堆、高烧不退,体温在40.8℃~41.5℃,并且病猪全身皮肤呈紫红色,有密集的出血点及出血斑,耳尖及四肢末梢发绀。

  1.3 样品采集

  在对病猪进行系统的临床症状观察和病史调查后,初步怀疑可能有猪瘟疫情,对患病猪进行了病理剖检并做出了初步判定。剖检时对病猪进行了病料采集,共采集了大脑、脾脏、淋巴结、扁桃体、肾脏、肺脏及肝脏等组织,每头猪的组织病料分开保存,并将各组织分成两份,一份冻存于-80℃冰箱,以备后续进行病原分离及病原检测,另一份则固定于10%中性福尔马林溶液中以备进行组织病理学检查。同时对发病猪场的经产母猪、断奶前仔猪及保育仔猪分别进行前腔静脉采血,分离血清,待检。

  1.4 实验室检查

  1.4.1 组织病理学检查

  将采集的组织病料经10%中性福尔马林固定后,制作常规石蜡切片,经苏木素-伊红(HE)染色后进行光镜观察。

  1.4.2 病原学检查

  将冻存于-80℃冰箱中的组织病料取出,解冻后取一部分加入适量灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)并研磨成匀浆,10000rpm离心4min后取上清,然后用病毒核酸提取试剂盒提取病毒核酸。依据Genbank公布的序列分别设计猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒野毒(PRV gE)及猪圆环病毒2型(PCV2)的特异性引物(表1),用PCR/RT-PCR方法进行扩增后,将扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳,电泳结束后在紫外凝胶成像仪下根据条带位置大小判定病猪的病原感染状况。

表1 PCR/RT-PCR引物序列

  1.4.3 病毒分离及CSFV E2基因序列分析

  将经过RT-PCR鉴定为CSFV阳性且其余病原阴性的病料匀浆液上清过滤(0.22μm滤器),将滤液接种于长满单层的猪肾(PK-15)细胞,盲传三代后收毒;将细胞及上清按上述方法提取核酸后,进行PCR鉴定。另外,设计扩增CSFV E2基因全长的特异性引物,对检测出仅CSFV阳性的核酸进行E2基因全长的扩增。将扩增所得产物进行胶回收纯化、并连接pMD 18-T载体、然后转化DH5α感受态细胞及挑菌培养,而后将经鉴定为CSFV E2基因阳性的菌液送至上海生工生物公司测序,对本研究中分离到的与GenBank中录入的CSFV的E2基因(表2)进行E2基因的核苷酸序列及氨基酸序列的比对分析,从而得出分离株的序列特征。

表2 Gen Bank中27株参考毒株E2基因的序列信息

  1.4.3 血清学检查

  为进一步明确该猪场的致病原因,同时监测该场CSFV的免疫状态,经前腔静脉无菌采集该猪场经产母猪血液10份、哺乳仔猪血液10份、45日龄保育猪血液10份,分离血清后使用猪瘟抗体检测试剂盒检测猪群猪瘟病毒抗体水平及其离散度。

  2 结果

  2.1 患病猪临床剖检结果

  临床检查可见该猪全身皮肤潮红(图1A);耳朵发绀(图1B)。剖检可见其全身淋巴结肿大出血,切面呈典型“大理石样”变化(图1C);脾脏边缘可见出血性梗死灶(图1D);肾脏表面可见弥漫分布的针尖至斑点大出血点(图1E);心外膜出血(图1F);剖开结肠可见肠黏膜表面覆盖一层糠麸样物质,剥离后可见结肠黏膜充血溃疡(图1G);膀胱黏膜表面可见大小不等的出血斑点(图1H);喉头出血(图1I)。

图1 病猪的剖检病变

Figure.1 Autopsylesions of the pigs

  A:病猪全身皮肤潮红;B:耳朵发绀。C:全身淋巴结肿大出血,切面呈大理石样变化;D:脾脏边缘有出血性梗死灶;E:肾脏表面弥漫分布针尖大至斑点大出血点;F:心外膜出血;G:剖开结肠可见肠黏膜覆盖一层糠麸样物质,剥离后可见结肠黏膜充血、溃疡;H:膀胱黏膜可见大小不等的出血斑点;I:喉头出血。

  2.2病理组织学检查结果

  将采集的固定于10%中性福尔马林溶液中的组织器官病料经常规石蜡切片、HE染色后镜检,能够见到典型的病毒性脑炎病变,大脑毛细血管周围可见大量淋巴细胞和单核细胞浸润形成“脑血管袖套现象”(图2A),变性坏死的神经元被胶质细胞吞噬,出现“噬神经现象”及“卫星现象”(图2B);淋巴结主要表现出血性坏死性淋巴结炎病变,可见淋巴细胞大量崩解坏死,细胞核浓缩深染、崩解破碎、溶解消失(图2C);心肌出血,肌纤维间散在红细胞(图2D);肾小球充血出血,肾小管上皮细胞变性、坏死,肾间质充血、出血(图2E);脾脏出血性梗死区充满红细胞(图2F)。

图2 病猪的组织病理学变化

Figure.2 Histopathological changes of the pigs

  A:典型的病毒性脑炎病变,大脑小动脉充血,周围有大量淋巴细胞和单核细胞浸润形成“脑血管袖套现象”,400×;B:神经元变性坏死,可见“噬神经现象”及“卫星现象”,400×;C:淋巴结内淋巴细胞崩解坏死,核浓缩深染、崩解破碎、溶解消失,200×;D:心肌纤维间散在红细胞,200×;E:肾小球充血、出血,肾小管上皮细胞变性、坏死,肾间质充血、出血,200×;F:脾脏出血性梗死区充满红细胞,200×。

  2.3病原学检查结果

  对采集的病料进行了猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒野毒及猪圆环病毒2型进行了检测,检测结果显示,病料样品中仅检出了猪瘟病毒,其它病毒则未检出,检测结果如图3所示。

图3 病料样品中相关病原的检测结果

(M: DL2000 DNA Marker;+: Positive control;-: Negative control;S: Sample)

  2.4病毒接种细胞后分离与鉴定结果

  将经RT-PCR鉴定为CSFV阳性且其它病原均为阴性的病料匀浆液用0.22μm滤膜过滤,然后接种到长满单层的PK-15细胞,置于37℃、5%CO2的条件下培养,PK15细胞在接种病料40h后,在显微镜下可见明显的细胞病变,以细胞圆缩、聚集和脱落为主要特征。继续培养至48h,此时细胞病变达70%时,收毒,将细胞瓶置于-20℃冰箱中进行反复冻融3次后,经10000rpm,5min离心后,用细胞上清提取核酸进行PCR/RT-PCR检测,结果仅有CSFV检出,并未检出PRRSV、PRV或PCV2,从而成功分离出该猪瘟病毒。

  2.5分离毒株与参考株E2基因核苷酸及氨基酸序列相似性结果分析

  我们分离到的病毒被命名为SDLW2017。该毒株的E2全基因扩增后进行测序,扩增片段大小为1402bp,其中E2基因全长为1119bp,共编码373个氨基酸。相似性分析结果表明,该分离毒株与其它参考毒株的核苷酸相似性在82.1%~96.3%之间(图4),氨基酸相似性介于88.5%~97.6%之间(图5)。该分离株与其它8个基因亚型的参考毒株相比(表3),与1.1亚型的HCLV株核苷酸(82.1%)和氨基酸相似性(88.5%)最低,而与2.1亚型的参考毒株具有较高的核苷酸(91.8%~96.3%)和氨基酸相似性(95.2%~97.6%)。其中SDLW2017与2.1b亚型参考毒株(GXWZ02)的同源性最高,核苷酸为96.3%,氨基酸为97.6%。此外,新分离株与2.1d亚型的同源性要高于2.1a及2.1c,这表明2.1b亚型和2.1d 亚型具有较高的相似度,这与之前的报道相吻合。

图4 SDLW2017与27个参考毒株E2 基因核苷酸序列的相似性

图5 SDLW2017与27个参考毒株E2基因推导氨基酸序列的相似性

表3分离株与CSFV 8个参考毒株的核苷酸及氨基酸相似性(%)

  2.6 分离毒株与CSFV参考株E2基因系统发育进化树分析结果

  将新分离株SDLW2017与27株参考毒株构建进化树,结果如图6所示。结果表明,这28株序列被分到了3个基因群(1,2,3)中,其中又包括8个基因亚群(1.1~1.4,2.1~2.3,3.4)。2.1 亚群在进化树中被突出显示,该亚群能被进一步划分为 2.1a,2.1b,2.1c及一个新被定义的2.1d基因亚群。我们分离得到的CSFV在进化树中处于2.1b亚群,其与传统的石门毒株(1.1)或兔化弱毒疫苗毒株(HCLV,1.1)相比,具有较大的差异。

图6 分离株与参考毒株的进化树分析结果

  2.7 血清中CSFV抗体水平检测结果

  抗体检测结果显示经产母猪整体阳性率偏低,平均抗体水平较低,且离散度大,哺乳仔猪得不到有效的母源抗体保护,极易受到外界野毒的感染;而保育猪平均抗体阻断率偏高,不符合一免之后的猪瘟抗体消长规律,怀疑有猪瘟野毒感染。CSFV抗体水平检测结果见下表4。

表4 不同阶段猪群猪瘟抗体水平

  #:离散度=标准方差/抗体平均值*100%,该值反映猪群抗体水平的离散度,变异系数越大表示抗体水平越不均匀。

  3讨论

  猪瘟作为我国畜牧业四大疫病之一,至今流行已超过70年。我国最先于1956年提出消灭猪瘟的计划,虽然在一定程度上控制了猪瘟在我国的暴发和大范围流行,但并未杜绝猪瘟在我国的不间断流行,并且其流行特点和发病特征也发生了很大变化,具体表现为:流行范围广,呈散发流行态势[6]。目前大多数猪瘟病例都是亚临床性的非典型猪瘟,主要引起妊娠母猪生殖障碍、新生仔猪成活率低及保育猪的慢性感染和发病。此外,分子流行病学调查结果显示,我国流行的猪瘟病毒,其基因型也在逐渐发生变化:中国兽医药品监察所等单位通过对1979~2008年间,从我国近60个地区猪场获取的440多份猪瘟病毒样品的基因序列分析结果比对,发现当前我国流行的猪瘟病毒基因型以基因2群为主,其比例高达74.66%,而基因1群只占25.34%[7]。2014年年底以来,我国一些常规免疫猪瘟疫苗的猪场发生了疑似猪瘟的疫情,且发病率较高[8]。2015年初,相似的疫情在也发生在了山东省的一些常规免疫猪瘟疫苗的猪场,并造成了不同程度的经济损失[9]。为查找引起该疫情的病原,并明确其发病机制,我们在莱芜某疑似猪瘟感染的猪场采集了一些病料并进行了系统的实验室检测,最终确认本次疫情系猪瘟病毒感染所致。

  本研究中,我们利用CSFV E2基因全长序列构建了系统发育进化树,发现该CSFV分离株与参考毒株(1.1、2.1、2.2、2.3和3.4)相比,处于2.1亚型,而且与其中的2.1b基因亚型具有最高的相似度,因而可以判定造成该场猪瘟疫情发生和流行的病毒株属于2.1b亚型。文献资料表明,该基因亚型的猪瘟病毒毒株能够导致易感猪群猪瘟的发生并造成较大经济损失,而传统C株疫苗的免疫难以有效阻止该毒株的流行和致病。由于本研究的局限性,未能对该病毒株的分子生物学特性、抗原性及病毒毒力等进行更深入的探究,但是可以推测该病毒株可能在传统C株疫苗免疫压力下发生了适应性进化,并且与当前猪瘟疫苗免疫效果较差有一定关系。

  抗体检测结果表明,该猪场保育猪平均抗体阻断率偏高,不符合一免之后的猪瘟抗体消长规律,极有可能为猪瘟野毒感染所致。确诊为猪瘟病毒感染后,通过采取猪瘟疫苗紧急免疫措施,使猪场疫情得到有效控制,猪场基本恢复正常生产。

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