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猪流行性腹泻的流行特点、诊断和防控技术

赛尔畜牧网 2017-05-24 16:06:19 |

[导读] 猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的肠道传染病

本文相关专题:赛尔兽药与养殖201705

  李明波,宋忠旭,禱-斌科,孙华,雷斌,郭锐,梅书棋

  湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室

  猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的肠道传染病,不同年龄阶段的猪都可感染,本病对初生仔猪的危害最大,5日龄以内的仔猪,由于腹泻和呕吐而造成的严重脱水,发病率和死亡率可达100%。自2010年以来,我国10多个省市和地区大范围发生了猪流行性腹泻,导致大量的新生仔猪死亡,给我国养猪业造成了巨大经济损失。经大量的病原学和流行病学研究证实,引起此次腹泻的病原主要为PEDV变异毒株。

  1 PED的流行情况

  PED于1971年首次在欧洲发现,1976年在比利时分离得到第一株病毒,命名为冠状样病毒CV777株。1992年以后在韩国和日本发生,PEDV阳性检出率为50.4%(1258例)。在中国,PEDV于1982年首次被分离,自20世纪90年代以来,PED在中国26个主要城市和地区养猪场连续发生,造成全国养猪业巨大的经济损失。

  2010年10月,中国南方部分地区开始大规模发生PED疫情,短期内疫情迅速扩散至全国,即使在疫苗免疫过的猪场,哺乳仔猪也未能获得保护,患病仔猪主要表现为黄色水样腹泻、消瘦和脱水死亡,随后经过病毒全基因组测序证实导致本次PED大规模发生的病原为PEDV变异毒株;杨汉春等也于2011年在我国部分地区15个猪场采集腹泻仔猪的临床样本234份,得出PEDV阳性率为82.1%,TGEV阳性率为5.6%,该研究表明猪流行性腹泻病毒是引起仔猪腹泻的最主要病原,以纤突蛋白编码基因(S基因)出现缺失、插入和突变为特征的变异毒株和传统CV777毒株共存,而传染性胃肠炎病毒(TGEV)和轮状病毒(ARV)在不同地区的感染水平有所差异。2013年PEDV变异毒株首次在美国流行,并蔓延到加拿大和墨西哥,现在PEDV已经在欧洲、亚洲、美洲等多个国家广泛流行。

  2 中国流行PEDV的分子特征

  PEDV与TGEV同属冠状病毒,属有囊膜单股正链RNA病毒,长约28kb,全基因组包括5'非编码区(UTR),3'UTR,至少7个开放阅读框(ORF),编码4个结构蛋白(S、E、M、N)和3个非结构蛋白(复制酶la和lb,以及ORF3),基因组上的顺序为5'-复制酶(la/lb)-S-ORF3-E-M-N-3'。在PEDV基因遗传进化分析中,尤其以S蛋白、N蛋白、M蛋白和ORF3研究得最多。

  为了分析PEDV毒株的遗传背景,研究者通过对PEDV全基因组进行进化树分析,将PEDV毒株分为G1(经典毒株)和G2(新型毒株)两个基因型,G1和G2分别含有两个亚型G1a、G1b和G2a、G2b。G1包括经典毒株、疫苗株及其它细胞适应培养株等,主要以CV777、LZC、SM98为代表的经典株,其它还包括韩国DR13弱毒株和国内早期分离的毒株;G2则均为2010年以后国内分离的PEDV变异毒株和北美新分离的PEDV变异株。李文涛等根据PEDVS基因进行核苷酸同源性分析发现,PEDV同群间核苷酸相似性从95.1%~100%不等,不同群间相似性从88.7%~96.7%不等。相对于CV777等经典毒株,目前中国主要流行的PEDV毒株已经发生了较大变异,通过比较PEDV变异毒株与经典毒株的编码基因发现,变异病毒的S基因(尤其是S1区)变化最大,变异株与经典株CV777相比,S1区域(1nt~2217nt)主要存在3个插入区域和一个缺失区域。通过序列分析发现,PEDV具有遗传多样性,同时也证明新型病毒可通过重组机制产生。此外,比较PEDV变异株和经典毒株S1的抗原中和表位发现,3个重要表位均发生突变,表明现行使用的经典株的灭活或弱毒疫苗均不能提供很好的保护。

  3 PED发病机理及临床特征

  PEDV通常首先感染养殖场阴性肥育或后备猪,累积的病毒感染怀孕母猪使之带毒,然后传至产仔舍,随后亚临床感染的母猪最终传染给哺乳仔猪。根据笔者最近观察,部分养殖场哺乳仔猪发生腹泻时,母猪往往不表现出明显的腹泻症状,这可能与母猪本身免疫过疫苗或者感染的PEDV毒力有关。

  PEDV感染猪体后首先在小肠绒毛上皮细胞增殖,造成线粒体损伤肿胀和营养物质吸收不良,进而引发上皮细胞损伤脱落,肠绒毛萎缩及吸收面积减小,最终导致渗出性脱水死亡。临床上表现为新生哺乳仔猪水样腹泻、凝乳性呕吐及脱水,10日龄仔猪感染出现腹泻2天~4天后,死亡率50%~100%。产房呈跳跃式传播,头胎和低胎龄母猪所产仔猪发病率较高,生物安全较差的养殖场哺乳仔猪可能会出现反复感染PEDV的现象;日龄较大的猪发病1周后可自然康复,死亡率低,但可导致体重下降和饲料利用率下降。

  消化道传播是PED主要的但并不是唯一的传播途径。王新平等发现,PEDV可在呼吸道内复制,经呼吸道分泌物向外排毒后感染易感猪群。除了常规的粪口途径传播,PEDV还可通过感染母猪乳謀-等途径传播。此外,PEDV的传播媒介还包括运输车辆、未经严格消毒的生产用具、筒靴、衣物、病毒污染的水源、饲料(血浆蛋白)、燕八哥、苍蝇等。PEDV潜伏期较短,猪只从接触病毒到表现出临床症状只需12小时~24小时,排毒周期一般为3周~4周。

  Hesse等给4周龄猪口鼻接种PEDV后,研究了病毒的组织定位、排毒方式、携带、抗体应答和气溶胶传播等发现,接种后21天大部分猪的粪便拭子和鼻拭子检测都为阴性,有些猪排毒时间可持续到接种后的35天;经免疫组化检测发现,猪只气管、肺脏和支气管淋巴结、脾脏等其它内脏组织均为PEDV阴性。

  4 PED的诊断技术

  4.1 PEDV病原学诊断

  流行性腹泻和传染性胃肠炎的临床症状相似,乳猪均表现呕吐、水样腹泻至脱水酸中毒死亡(粪便腥臭),因此在实验室对PEDV进行鉴别检测是非常有必要的。一般采集刚发病仔猪的粪便和肠道内容物、母猪乳謀-进行病原学鉴别诊断,诊断方法主要包括免疫荧光(IF)、免疫组化技术、电镜观察、RT-PCR(荧光定量)等。

  PEDV变异毒株虽然在S基因上变化显著,但在M基因上还是相对保守,针对M基因的诊断方法依然有效。如张坤等建立了针对PEDV M基因、TGEV N基因、ARV(轮状病毒)VP7基因的多重RT-PCR检测方法。近年来,国内外学者基于PEDV S、ORF3、M基因陆续开展了针对流行性腹泻变异毒株和经典毒株的鉴别诊断及荧光定量RT PCR诊断技术的研究,为猪急性肠炎病毒的检测提供了快速、敏感的实验室诊断方法。同时,基于N、M蛋白的单克隆抗体技术ELISA(酶联免疫吸附试验)检测方法也得到了初步应用,但该方法的特异性、敏感性和稳定性等方面还需要进一步研究。

  4.2 血清学诊断技术

  血清学方法是另外一种有效监测猪群中PEDV的手段,目前间接免疫荧光试验(IFA)和中和抗体试验是常用的血清学方法。基于PEDV S基因的S1部分,Gerber等用建立的S1-ELISA方法对239个场的血清样品进行检测,诊断的敏感性为100%,特异性为94%。进一步研究表明,猪只抗PEDV的IgA、IgG抗体含量在人工接种PEDV后3周~4周逐渐减少,IgA抗体用于监测体液免疫应答的特异性更高,可有效反映PEDV被动免疫保护能力。国内学者丁振絓-等也建立了基于PEDV S1D蛋白为包被抗原的IgA-ELISA抗体检测方法,为临床评价母源黏膜抗体保护力提供了基础。

  5 PED的免疫预防

  5.1 PED疫苗

  国内最先研制的PED疫苗是组织灭活苗。1995年,马思奇等研制了商品化的PEDV和TGEV二联灭活疫苗,该二联苗能够有效地预防TGEV和PEDV的感染,经后海穴注射,TGEV和PEDV主动免疫的保护率分别可达100%和92%,被动免疫的保护率可达87.9%和84.2%。1998年,佟有恩等研制了PEDV TGEV弱毒二联苗,主动免疫与被动免疫的保护率为97.7%和98%。这两种商品化疫苗使用的PEDV毒株是CV777株,在2010年前,这两种疫苗为控制PEDV和TGEV的传播发挥了重要作用。从2010年至今,我国猪场广泛采用自家疫苗、商品化疫苗和返饲等方式来控制PED的发生,但效果并不理想,主要是缺乏对PEDV变异株的免疫机理和致病性的了解。

  1997年以来,日本和韩国先后在Vero细胞上传代培养开发了PEDV弱毒疫苗(P5-V和DR13株),试验表明弱毒疫苗通过口服比肌注效果更好,因为口服疫苗后仔猪的死亡率相对于肌注的要低,并且抗体水平要高得多。2013年,美国研制使用了两种PEDV灭活疫苗,结果表明该疫苗免疫4周龄的仔猪后可诱导较强的体液免疫。

  2015年,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的TGEV(H弱毒株)、PEDV(CV777弱毒株)和ARV(G5型)三联活疫苗开始应用于临床猪场。鉴于目前流行的PEDV变异株与经典毒株存在较大差异,因此有必要针对流行的变异毒株研制新的疫苗。当前中国研究者开始以PEDV变异毒株为基础,初步研制了灭活和弱毒疫苗,动物试验结果显示,两种疫苗能对PEDV变异毒株提供很好的免疫保护。

  新型疫苗方面,我国研究者徐丽丽等开展了PEDV重组减毒的沙门氏菌口服疫苗的研究,Liu等构建了表达PEDV-N基因或S1基因的重组乳酸杆菌,研究表明口服后能有效刺激仔猪肠道产生黏膜免疫应答。这些研究为研制更高效的PEDV口服疫苗奠定了基础。

  5.2 PED的免疫措施

  由于PEDV是肠道病毒,黏膜免疫在抵抗PEDV的感染中发挥着重要作用,因此通过消化道给予疫苗免疫(主动和被动免疫),以此激发肠道黏膜免疫(尤其是sIgA抗体的产生)应是预防该病的最佳选择。当前PEDV疫苗和免疫仍然存在一些问题:一是灭活疫苗肌注后只能诱导乳腺产生低滴度的IgG,并且IgG持续时间短,不能产生有效的黏膜免疫(IgA)抗体和细胞免疫反应,可在活病毒感染或弱毒苗接种后,利用新毒株制备的疫苗重复接种增强其免疫保护效果;二是PEDV在Vero细胞上培养困难,导致弱毒疫苗滴度低,其次弱毒疫苗口服后在猪胃肠道增殖能力下降,产生保护力有限。

  鉴于目前PEDV的特点和当前疫苗免疫效果,可以使用低代次的PEDV口服免疫的同时结合变异株的自家疫苗(由有资质的科研院所制备)或灭活疫苗进行联合免疫种母猪,可以达到较好的免疫效果。

  6 PED的临床控制

  6.1 紧急控制措施

  猪场发生PEDV疫情时应及时确诊并采取有效措施。一是发病肥育猪或后备猪栋舍应隔离和封锁,避免病毒在场内扩散。二是对产前4周以上妊娠母猪可紧急接种疫苗,4周以内母猪转入单独产房(消毒干燥),已感染PEDV的产房哺乳母猪及小猪由专人护理,并作隔离处理,停止疫苗注射等工作。三是对10日龄以内猪只实行人工乳喂养和同一产房内未发生腹泻健康母猪的寄养,脱水严重的仔猪应及时淘蘚-处理。四是日龄较大仔猪及时转出产房,进行补液治疗,或在料槽中补充口服补液盐水和蒙脱石散类吸附剂,并对发病猪舍隔离、彻底消毒干燥及空栏净化。

  6.2 日常预防措施

  加强饲养管理,减少环境应激,提升母乳(初乳)质量和水平。稳定控制产房和保温箱的温、湿度。免疫控制PCV2、净化猪场伪狂犬病和猪瘟等疾病。对出生1天~3天仔猪可口服微生态和免疫因子复合制剂。强化隔离和生物安全措施,猪场人员及进出车辆严格消毒以及对发病猪的无害化处理等,选用敏感的消毒剂(如戊二醛喷雾、甲醛熏蒸等),猪舍外部环境(赶猪通道、上猪台、粪道等)泼撒生石灰或烧碱消毒。产房消毒后保持干燥至少7天以上再转入下一批次猪。

  7 展望

  当前PED仍然是严重危害我国养猪业的重要疾病之一。由于PEDV具有高度变异的特性,发生病毒性腹泻疫情的猪场可能是多种病原并存,这给PED的诊断、疫苗研制及临床防控带来了极大的挑战。随着PEDV变异毒株的广泛流行,关于PEDV的基础研究在国内外也得到了快速推进,目前我国已解析了60多株PEDV的全基因组及其遗传特征,并开展了PEDV分子流行病学、病毒的增殖培养特性、感染和致病机理、病毒与宿主免疫系统相互作用等方面的研究,将有助于今后PED诊断试剂、新型疫苗和临床防控技术的研发,为预防和控制PED的传播发挥重大作用。

  梅书棋Email:msqlfe@163.com

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