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简述溶菌酶的研究现状

赛尔畜牧网 2017-07-26 15:28:22 |

[导读] 溶菌酶(Lysozyme,LYZ),又称胞壁质酶(muramidase),其化学名称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase),是一种稳定的碱性蛋白酶。

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李红1,2,易建中1,刘成倩1,孙晓云3,严华祥1

1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所;2.上海佳牧生物制品有限公司;3.上海海洋大学

1 溶菌酶简介

溶菌酶(Lysozyme,LYZ),又称胞壁质酶(muramidase),其化学名称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase),是一种稳定的碱性蛋白酶。它可对细菌细胞壁肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺、以及N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键进行水解,促进细菌细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,降低细菌细胞壁的稳定性,导致细胞壁裂解内容物溢出,并最终引起细菌溶解。在与带负电荷的病毒蛋白相互结合的情况下,溶菌酶能够与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐。这种复盐具有使病毒失去活力的特性。研究表明,溶菌酶能够在不破坏其他组织的前提下,有选择地对微生物的细胞壁进行分解。这种特性就使得溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力、促进双歧杆菌等有益菌增殖的独特功效。

据研究,溶菌酶作为单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的产物,对革兰氏阳性菌有显著的抑菌效果。而且,溶菌酶作为碱性蛋白酶,是生物体内重要的非特异性免疫因子,在抑杀病原体时不易产生抗药性。溶菌酶的这种与抗生素不同的抑菌机制已经得到重视,并应用于食品级药品当中。另外,有文献证明溶菌酶可作为免疫调节和免疫激活剂,在免疫系统中起着重要作用。

溶菌酶的研究先驱者是欧洲学者Nicolle,他早在1907年就对枯草芽孢杆菌中的溶解因子(lytic factor)进行研究。接下来在1922年,Fleming等首次在人类的眼泪、唾液中发现溶菌酶。由于此酶具有溶解细胞壁杀死细菌的特征,因此Fleming将其命名为“溶菌酶”。学者Robinson等在1937年从卵蛋白中首次分离出溶菌酶晶体,为进一步揭示溶菌酶的内在构造奠定基础,这揭开了溶菌酶研究的新篇章。1965年英国学者Blake等人使用X衍射法对存在于鸡蛋蛋清中的溶菌酶进行三维结构分析,彻底揭示出溶菌酶的立体结构。

研究表明,溶菌酶广泛存在于四类生物组织:第一,高等动物的组织器官,如肝、肾、淋巴结、肠道等;第二,高等动物的分泌物,如家禽、鸟类的蛋清和哺乳动物的眼泪、乳汁、唾液、血液、鼻黏液、尿液。第三,部分植物体内,如木瓜、卷心菜、白萝卜、大麦、芜菁和无花果等;第四,一部分微生物体内。科学家还发现,鸡蛋蛋清是自然界中溶菌酶含量最为丰富的生物组织,溶菌酶的含量高达3.4%~3.5%。目前,鸡蛋已经成为提取溶菌酶的首选和最佳来源。鸡蛋蛋清溶菌酶也成为人们了解和研究最为透彻的一种溶菌酶形态。

鸡蛋蛋清溶菌酶的分子量为14000,一级结构由129个氨基酸组成,其稳定性主要与多级结构中的4个二硫键、氢键及疏水键有关,而且通过肽键上的Glu35和Asp52构成的活性部位水解破坏组成微生物细胞壁的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸间的β-1,4糖苷键,使革兰氏阳性菌细胞壁溶解而杀死细菌的目的。另外,人溶菌酶一级氨基酸结构不同于蛋清溶菌酶,其分子量为14600,由130个氨基酸组成,其中含有4个S-S键,但它们三级结构有相似性。人溶菌酶活性比鸡蛋清溶菌酶活性高2倍。目前实验已经从哺乳动物如牛、马、羊、猪、兔、猴等动物的乳汁中分离出溶菌酶,其化学性质相似于人溶菌酶,但活性低于人溶菌酶,结构现在还不清楚。

目前工业提取溶菌酶的方法多种多样,传统的如结晶法;目前常用的有离子交换层析法、亲和层析法、超滤法等。溶菌酶在工业应用上的使用大致包括如下几个方面:第一,测定禽类机体非特异性免疫功能的指标。尽管溶菌酶在禽类体内的作用尚未完全被揭示,但是一般认为,禽类血清、体液和分泌物中溶菌酶的含量与机体防御功能密切相关。因此,测定禽类血清、体液和分泌物中溶菌酶的含量及其变动情况,可以成为评价机体非特异性免疫功能的有力依据。

2 影响溶菌酶活性的因素

溶菌酶的使用需要充分地掌握溶菌酶的酶学特性,因为每一种溶菌酶的最适反应条件各有差异。为了测定不同因素对蛋清溶菌酶活性的影响,刘慧等选择了不同的因素(pH,温度)和辅料(金属离子和助溶剂)进行研究。研究结果发现,蛋清溶菌酶在pH6.0~6.5时活性最强,pH5.0~7.0范围内酶活性相对比较稳定,pH大于7时溶菌酶活性急剧下降;温度为65℃时酶活性最强,在25℃~65℃范围内随着温度的升高酶活性增强,但高于65℃则变性失活。另外,对溶菌酶活性产生轻微激活作用的有金属离子K+、Na+;而对酶活性不产生明显影响的则有Mn2+、Mg2+;让酶活性产生降低的则有Cu2+、Fe2+、Zn2+、Co2+、Ca2+。研究还发现,吐温80、吐温20、甘油溶液对酶活性有抑制作用;EDTA-2Na在0.0005%~0.3000%浓度范围内对酶活性有激活作用,浓度继续增加反而有抑制活性作用。

3 溶菌酶的分类

溶菌酶具有很强的底物特异性,不同来源的溶菌酶其作用底物也有所差异。根据来源的不同,溶菌酶可分为动物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和噬菌体溶菌酶。其中,动物源溶菌酶是数量最多、种类最多、分布最广的一种,包括c型(chickentype)、g型(goose-type)和i型(invertebrate-type)溶菌酶。动物源溶菌酶从节肢动物、环节动物、软体动物到鸟类以及哺乳动物(牛),研究人员分别对其进行了不同程度的研究。

根据作用细胞壁的不同,溶菌酶可分为细菌细胞壁溶菌酶、真菌细胞壁溶菌酶。根据作用位点的不同,溶菌酶可分为β-1,4糖苷键的细胞壁溶菌酶、肽链“尾”端和酰胺部分的细胞壁溶菌酶。又可细分为酵母菌细胞壁溶菌酶、霉菌细胞壁溶菌酶。

目前主要分为7种:内N-乙酰己糖胺酶,与鸡蛋清中溶菌酶相同,破坏细菌细胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷键;酰胺酶,切断细菌细胞壁肽“尾”与肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖胺之间的N-乙酰胞壁酸-L丙氨酸键;内肽酶,切断肽“桥”与肽“尾”内的肽键;β-1,3、β-1,6葡聚糖和甘露聚糖酶,此酶降解酵母细胞的细胞壁;壳多糖酶,与葡聚糖酶共同作用分解霉菌细胞壁;磷酸甘露糖酶,与葡甘露糖酶共同作用,分解原生质;脱乙酰壳多糖酶,主要作用于毛霉和根酶。

4 溶菌酶的主要应用

4.1 溶菌酶在食品上的应用

目前,溶菌酶在红肠、香肠等肉类制品以及鱼丸等水产类熟制品的制作过程中常常被用作防腐剂。马美湖等人比较了冷却肉生产中溶菌酶、Nisin、Gna液的保鲜效果,发现当溶菌酶、Nisin、Gna液分别单独使用时,溶菌酶极明显优于对照组,略好于Nisin组,显著好于Gna组。

另外,溶菌酶还被用于低温肉制品的保鲜。如低温保鲜剂Hnsafely-010(溶菌酶制剂)可以耐受低于95℃的温度,而不影响其性质。与低温肉制品保鲜期相比,Hnsafely-010保鲜剂可以延长保鲜期一倍以上的时间。一些海鲜产品和水产品在0.05%溶菌酶和3%的食品溶液中浸渍5min后,低温、常温保藏时间都得到延长。

在奶制品中,人乳的最高溶菌酶含量为山羊乳的1600倍,牛乳的3000倍。溶菌酶是一种婴儿生长发育不可或缺的抗菌蛋白。溶菌酶便于胃肠内乳酪蛋白形成微细凝乳,利于婴儿消化吸收;可以促进人工喂养婴儿肠道细菌群的正常化;能够加强体内防御因子,增加对感染的抵抗力,对早产婴儿在预防体重减轻方面有明显的功效。值得一提的是,在人工喂养或食用母乳不足的情况下,溶菌酶添加到婴儿食品中能够有效抑制肠道中腐败微生物的生存,并且可以促进肠道中双歧杆菌的增殖。因此,溶菌酶是婴儿食品、婴儿配方奶粉等的良好添加剂。

另外,溶菌酶具有一般防腐剂不能达到的特性就是它不仅促进乳酸菌生长,而且能抑制污染菌引起的酪酸发酵。因此,添加到奶酪中的溶菌酶可以防止奶酪的后期起泡,以及奶酪风味变化。溶菌酶作为防腐剂可用于巴氏杀菌奶,对奶的保质期有明显的延长作用,由于其具有一定的耐高温特性,也适用于超高温瞬时杀菌奶。糕点中的奶油使糕点容易腐败,如果在糕点中加入溶菌酶作为防腐剂,可防止糕点中微生物的增殖。

由于蛋清中溶菌酶含量与酶活力呈现正相关的关系,因此蛋清中溶菌酶越高,越有利于鸡蛋的保存。鉴于这种特性,鸡蛋蛋清中的溶菌酶对我国禽蛋产品加工产业具有重要意义。

4.2 溶菌酶在医学和体育上的应用

溶菌酶能够参与粘多糖代谢,可作为对抗微生物感染的酶类抗菌药。在内服和外用药配合使用下,溶菌酶对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等疗效明显,对慢性鼻炎、慢性咽喉炎及扁平疣等也有辅助治疗的作用。另外,将溶菌酶与抗生素合用还有助于预防龋齿。实验证明,用含溶菌酶的漱口液漱口或口含含有溶菌酶的口腔药片,可以让口腔内细菌显著地减少。在环境卫生学中,测定唾液中的溶菌酶活性是一个常用的非特异性免疫指标,可以被用于检测毒物对机体免疫功能的影响。溶菌酶甚至还被用于诊断白血病。含有溶菌酶的润喉液、眼药水还可以用于抑制流行性感冒和腺病毒,具有抗感染及抗炎症的功效。溶菌酶的溶菌作用也可以针对耐药性细菌,并对人体具有极弱的副作用。有鉴于此,溶菌酶成为颇受青睐的药用酶。

在体育领域,溶菌酶被用于评定运动员的身体机能。溶菌酶作为机体非特异性免疫因子,能反映机体的免疫能力,是一项较灵敏的亚临床指标。因此,相对于身体状态良好的运动员,状态不佳的运动员具有较低的唾液溶菌酶滴定值。唾液溶菌酶的测定方法简单易行,取样方法对人体不产生任何损伤。而且,这种方法有利于长时间追踪观察,因此被广泛用于训练期和恢复期的机能评定。

4.3 溶菌酶在饲料中的应用

科学实验发现,溶菌酶具有替代抗生素的作用,能提升饲料的喂养效率、降低细菌的易感性和增加病原体脱落,最大限速地减少养猪生产损失。美国食品及药物管理局为了限制饲料中的抗生素滥用,鼓励溶菌酶在饲料领域的使用。美国农业部农业研究中心于2013年对溶菌酶影响动物生长性能的问题进行研究,发现猪饮食中添加溶菌酶可有效改善猪的生长性能。在实验中,猪在食用溶菌酶组或抗生素之后的生长速度大大提高,比食用未添加药物的牛奶替代品的猪提高了12%。另外,猪进食含溶菌酶的流质食物,可以有效改善小肠形态,从而降低弯曲杆菌胃肠道中的疾病发病率。王晓可等发现溶菌酶使用于仔猪饲料中,可以降低料肉比和腹泻率,提升猪的日增重和采食量,提高仔猪的健康水平。在不添加抗生素的情况下,鸡饲料中添加溶菌酶还可以改善禽类生长性能,提高血清中的溶菌酶含量和免疫功能,促进更多的家禽抵御疾病侵害,更易成活和健康生长。

4.4 溶菌酶在科研上的应用

溶菌酶是细胞工程和基因工程的一种不可或缺的工具酶。人们利用溶菌酶制造和提取菌体内的活性物质,例如酶、核酸和活性多肽等。另外,溶菌酶具有专一性水解细胞壁的特征,有助于人们深入了解细胞壁的细微结构。因此在生物技术、生物工程中,溶菌酶作为破壁酶,在微生物育种以及微生物分类等学术研究中被作为专用试剂。

近年来,人们还进行了如下的新尝试:第一,将溶菌酶固化在食品包装材料上,以此生产出抗菌、保鲜功效的食品包装材料;第二,将溶菌酶固化在空气过滤器上,使其发挥出除尘和高效杀菌两大作用;第三,利用溶菌酶可降解海洋生物高分子壳聚糖的特性,生产能被人体吸收,具有低分子量,具有独特生理活性和功能性质的低聚壳聚糖。

5 小结

溶菌酶是一种绝佳的天然蛋白质,兼具防腐、保健和药理三种功能,既对人体没有毒性,也不会残存于人体,还能在胃肠内被消化和吸收。因此,溶菌酶作为安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品,已经被用在饮料或加工食品中。在倡导绿色、环保、健康的今天,人们对食品和医药的安全性要求越来越高,溶菌酶作为一种替代抗生素、传统防腐剂的优良产品,具有安全、高效、具有天然活性成分的优势,因此其应用前景令人乐观。不过,为了进一步掌握每一类溶菌酶及其最适的反应条件,弄清溶菌酶的酶学特性,需要探究水分、离子强度、pH等因素对酶活性的影响,促使酶活力得到最大程度的发挥。在食品行业,还需要进一步弄清产生食品腐败的微生物种类,以及研究如何增强溶菌酶对革兰氏阴性细菌的溶菌作用,以便促进溶菌酶的溶菌防腐功效。

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